Быть ли темопольной микроскопии как методике лабораторной диагностики у пациентов с сифилисом в 21 веке

Введение:

В настоящее время одним из серьезных вопросов при заболевания сифилисом была и остаётся его диагностика. Диагностика сифилиса представляет собой комплекс мероприятий, которые проводятся для установления присутствия в организме человека возбудителя заболевания - бледной трепонемы (T. pallidum) прямыми и непрямыми методами исследования. Прямыми методами определяют саму бактерию, а непрямыми методами исследуют кровь на наличие антител к ней. Следует учитывать, что в зависимости от стадии заболевания результаты анализов могут быть отрицательными при наличии заболевания, что затрудняет дальнейшую диагностику инфекции. Поэтому для диагностики сифилиса обязателен комплекс исследований в котором необходимо одновременно использовать сразу несколько методик исследования, чтобы не пропустить начальную стадию заболевания или серонегативный сифилис. Говоря о темнопольной микроскопии – обнаружение бледной трепонемы этой методикой возможно на любой стадии заболевания, все зависит только от профессионализма и грамотности врача.

Материалы и методы:

В лабораториях нашего центра МНПЦДК ДЗМ используются все методики лабораторной диагностики сифилиса:

• Методы непосредственного выявления возбудителя в материале из очагов поражения (прямые тесты):

 −    темнопольная микроскопия;

 − молекулярно-биологические методы детекции ДНК бледной трепонемы (полимеразная цепная реакция или ДНК-зондирование);

• Методы серологической диагностики сифилиса, базирующиеся на выявлении антител к возбудителю сифилиса в сыворотке крови (или в спинномозговой жидкости)

 − РМП;

 − VDRL;

 − ИФА;

 − РПГА;

 − РИБТ;

 − РИФ.

Рассмотрим подробнее методику Темнопольной микроскопии.

Для того, чтобы исследование на сифилис в темном поле (темнопольная микроскопия) было максимально информативным, рассмотрим подробно этап взятие материала. Материалом темнопольной микроскопии является серозное отделяемое с поверхности эрозии, язвы, мацерированной или экскорированной эрозированной папулы или бляшки. Взятие материала должно проводится после тщательной и осторожной, нетравмирующей гигиенической обработки поверхности клинических проявлений с помощью марлевого тампона, смоченного стерильным физиологическим раствором. Очистка проводится с целью механического удаления другой флоры, которая может затруднить исследование. Важно не травмировать поверхность и не получить кровотечение, так как наличие в препарате лейкоцитов и эритроцитов значительно усложняет исследование.                                            

Для получения исследуемого материала - тканевой жидкости существует несколько методов:

- Метод раздражения.

Элемент клинического проявления (твердый шанкр, мокнущая папула, широкая кондилома и т.д.) тщательно очищают тампоном, смоченным стерильным физиологическим раствором. Стерильной ложкой Фолькмана производят осторожные поглаживающие движения по поверхности элемента, чтобы не вызвать кровотечение. Через несколько секунд – минуту поверхность становится блестящей в результате просачивания тканевой жидкости. Она прозрачна, бесцветна или слегка желтоватого цвета. Полученное серозное отделяемое смешивается на предметном стекле с равным количеством физиологического раствора, накрывается покровным стеклом, и полученный нативный препарат микроскопируется.

- Метод сдавливания.

После очистки эрозию или язву сдавливают с боков стерильным пинцетом, при этом стимулируется выделение серозного экссудата, который забирают с поверхности ложкой Фолькмана. Полученное серозное отделяемое смешивается на предметном стекле с равным количеством физиологического раствора, накрывается покровным стеклом, и полученный нативный препарат микроскопируется. Этот метод часто комбинируется с методом раздражения.

- Метод скарификации. 

К нему прибегают при исследовании сухих элементов (розеолы, эпителизированных эрозий, лентикулярных папул) Поверхность исследуемого элемента скарифицируют, при этом неизбежно появляется капилярное кровотечение которое останавливают прижав томпон к поверхности элемента и методом раздражения скарифицированной поверхности получают серозную жидкость. Полученное серозное отделяемое смешивается на предметном стекле с равным количеством физиологического раствора, накрывается покровным стеклом, и полученный нативный препарат микроскопируется. Этот метод существенно уступает предыдущим методам по эффективности.

Ход проведения исследования. 

Исследование в темном поле на бледную трепонему (T. pallidum) проводится с помощью стандартного микроскопа, снабжённого конденсором темного поля, в котором центральная часть затемнена и проникновение лучей света происходит через узкую боковую щель, для этого необходим сильный источник света. За счет бокового освещения достигается отраженное свечение на темном поле всех твердых частиц в препарате, в том числе бледной трепонемы (T. pallidum). Что образует интересный оптический эффект- который называется феноменом Тидаля, который обычно сравнивают со звездным небом. Препарат для проведения исследования готовят следующим образом.

На тонкое чистое обезжиренное стекло помещают каплю физиологического раствора комнатной температуры, рядом наносят такую же каплю полученного материала тканевой жидкости, после чего капли смешивают и накрывают покровным стеклом. На верхнюю линзу конденсора помещают каплю дистиллированной воды, после чего препарат помещают на столик микроскопа. Таким образом, между конденсором и препаратом создается однородная среда, что препятствует отклонению световых лучей. Исследование проводят без иммерсионного масла, объектив 40, окуляр – 10-12. В ходе исследования, получение изображения темного поля достигается правильным направлением узкого пучка яркого света из осветителя на зеркало микроскопа и соответствующими настройками макро- и микровинта микроскопа. При исследовании в темном поле бледная трепонема (T. pallidum) выглядит в виде очень нежной светящейся серебристым блеском подвижной спирали с несколькими завитками (рис.1.) или в виде пунктира, который слегка переносится движение жидкости в препарате.                           

Темнопольная микроскопия — этот метод микроскопических исследованный получил свое широкое применение в диагностике сифилиса и некоторых других заболеваний в связи с тем, что спирохеты имеют плохую способность к окрашиванию красителями и их можно увидеть только при правильном направлении света.

Рис.1.  T. Pallidum в темном поле.

В качестве примеров и в наше время методики темопольной микроскопии для исследования на бледную трепонему (T. pallidum) приводим наблюдения из собственной практики в клинико-диагностической лаборатории филиала «Клиника им. В.Г. Короленко» МНПЦ ДК ДЗМ.

Пациент Н., 25 лет, обратился на амбулаторный прием к дерматовенерологу в связи с появлением шанкра на локте. После проведенного осмотра были назначены следующие исследования – РМП, ИФА, РПГА. Результаты серологических исследований на сифилис были отрицательными, но клиническая картина и анамнез больного указывали на сифилис. Дерматовенеролог назначил дополнительно исследование на бледную трепонему (T. pallidum) в темнопольной микроскопии – где была обнаружена бледная трепонема (T. pallidum) и материал из шанкра был отправлен на исследование методом ПЦР – который так же дал положительный результат. Пациенту был поставлен диагноз «серонегативный сифилис».

Пациент С., 40 лет, обратился на амбулаторный прием к дерматологу c диагнозом пиодермия, поставленным им ранее терапевтом в другой поликлинике, там же было проведена экспресс диагностики на сифилис- РМП. После проведенного осмотра дерматологом было назначено повторное исследование – РМП. Результаты так же были отрицательными. Однако из анамнеза и осмотра больного были выявлены рубцующаяся язва на подбородке, увеличенные лимфатические узлы и пациент подтверждает беспорядочные половые связи с разными партнерами. Дерматолог назначил дополнительно исследование на бледную трепонему (T. pallidum) в темнопольной микроскопии – где была обнаружена бледная трепонема (T. pallidum) и материал был отправлен на исследование методом ПЦР – который так же дал положительный результат. Пациенту был поставлен диагноз «серонегативный сифилис».

Вывод:

  Эпидемиологическая ситуация продолжает оставаться напряженной: в структуре сифилиса преобладают скрытые формы, растет число поздних форм инфекции, что диктует необходимость усиления эпидемиологического контроля над распространением заболевания и широкого применения врачами-дерматовенерологами не только современных высокочувствительных и специфичных методов лабораторной диагностики сифилиса, но при этом необходимо не забывать об истоках лабораторной диагностики – микроскопии в темном поле. Метод темнопольной микроскопии имеет особую важность и значимость при диагностике первичного серонегативного сифилиса (при отрицательных результатах КСР), при диагностике нейросифилиса (обнаружение спирохеты в ликворе) и диагностике реинфекции сифилиса.  Так же темнопольная микроскопия является одним из самых дешевых и быстрых методов диагностики сифилиса. Метод темнопольной микроскопии единственный позволяет увидеть бледную трепонему (T. pallidum) в живом состоянии.

1. Диагностика сифилиса: от вассермана до наших дней. Потекаев Н.Н., Фриго Н.В., Ротанов С.В. Владимир 2018г
2. Сифилис: учебное пособие / Разнатовский К. И., Клибсон С. К., Полухина О. Э., Согомонян Л. С. Санкт-Петербург. СЗГМУ им. И. И. Мечникова, 2017
3. Руководство по лабораторной диагностике сифилиса в странах восточной Европы. Соколовский Е., Фриго Н.В, Ротанов С.В, Савичева А., Доля О., Китаева Н., Халлен А., Унемо М., Домейка М., Баллард Р. и Восточно-Европейская система сексуального и репродуктивного здоровья* 2008г.
4. Клинические рекомендации – Сифилис. Министерство здравоохранения российской федерации. 2020г.
5. Лабораторная диагностика сифилиса: Учебное пособие для врачей. Екатеринбург. УГМА. 2013г
6. Метод темнопольной микроскопии. Coles A.S. 1909г.
7. Учебно-методическое пособие – Лабораторная диагностика сифилиса. Понкратов В.Г., Понкратов О.В. Евсиенко И.А. Минск 2007г.